Chronická toxicita Studie chronické toxicity na myších, potkanech a psech prokázaly toxické účinky v podobě gastrointestinálních lézí, myelosuprese a hepatotoxicity.
Mutagenní a karcinogenní potenciál Dlouhodobé studie na potkanech, myších a křečcích neposkytly žádný důkaz nádorového potenciálu methotrexátu. Methotrexát vyvolává genové a chromozomové mutace jak in vitro, tak in vivo. Existuje podezření na mutagenní účinek u lidí.
Reprodukční toxikologie Teratogenní účinky byly zjištěny u čtyř druhů zvířat (potkani, myši, králíci, kočky). U opic rhesus se nevyskytly žádné malformace srovnatelné s lidmi.