Testy akutní toxicity prokázaly nízkou toxicitu gentamicinu u myší, potkanů, králíků, morčat a opic. Hodnoty LD50 ležely mezi 20 mg/kg a 180 mg/kg po intravenózním podání a mezi 430 mg/kg a 780 mg/kg po podání intramuskulárním. Po opakovaném podávání dávek až 200 mg/kg denně potkanům, králíkům, psům a morčatům po dobu až 50 dní byly toxické změny zjištěny především v ledvinách a sluchovém ústrojí. Po opakované aplikaci se v místě podání objevily topické toxické účinky. Gentamicin neovlivnil fertilitu ani reprodukční funkce. U laboratorních zvířat byly pozorovány embryotoxické účinky. Gentamicin nemá mutagenní ani karcinogenní účinky.