Timolol je beta-sympatolytikum bez vlastních sympatomimetických účinků anebo lokálně anestetických vlastností (stabilizujících membrány). Timolol snižuje stimulující účinek katecholaminů na srdeční sval. Blokádou účinků katecholaminů na srdce dochází ke zpomalení vedení vzruchu v AV uzlu, snižuje se srdeční frekvence a tepový objem. Blokádou receptorů v bronších se zvyšuje dechový odpor.
Působení na oko: timolol snižuje jak zvýšený, tak i normální nitrooční tlak. Přesný mechanismus působení není znám. Na základě fluorometrického sledování a tonografických šetření je možno soudit, že jeho účinek spočívá především ve snižování produkce nitrokomorové vody. Ve studiích s Arutimolem bylo zjištěno i mírné zvýšení odtoku komorové vody.
Pediatrická populace O použití timololu (jedna kapka 0,25 % či 0,5 % roztoku dvakrát denně) u pediatrické populace s trváním léčby do 12 týdnů jsou k dispozici jen velmi omezené údaje. Jedna publikovaná malá dvojitě slepá randomizovaná klinická studie provedená u 105 dětí (n = 71 léčených timololem) ve věku od 12 dnů do 5 let do jisté míry prokázala, že timolol v indikaci u primárního kongenitálního a primárního juvenilního glaukomu je v krátkodobé léčbě účinný.